張金堅：單細胞基因定序分析，有助於癌症研究發展

本文摘自《常春月刊》498期

文／張金堅

細胞是構成生物體的最基本單位，不同形態的細胞在特定的空間位置，彼此之間會互相作用或互通訊息，就像癌腫瘤，除了大部份是充滿癌細胞外，還夾雜一些其他形態的細胞，甚至周圍微環境，也充斥像纖維母細胞、免疫細胞等，彼此都有相互之關係，發揮其特有的生物學功能。

細胞間細微的表現差異，就有可能產生某種疾病。在過去都是將一團混合細胞（bulk）整體分析，就像一道沙拉，是把裡邊的各種蔬菜、水果、堅果統合一起分析，然後取其平均值，無法呈現單一細胞的實際狀況。近10年來，越來越多的分子生物學研究，朝向以「單一細胞」作為分析單位，更細膩的探討組織中細胞在基因組、轉錄組的表現，即所謂「單細胞定序」（single cell sequencing），其扮演非常重要的角色。

在2020年，單細胞空間轉錄組分析（spatial transcriptomics）入選《自然期刊》（Nature）年度最佳技術，所謂單細胞定序分析就像是從一道沙拉中，分離出確切水果種類、組成數量的方法，不再像傳統定序法，只能取一團混合細胞的平均值，而是透過各個細胞的定序分析，並拼組其在空間的分佈，深入完整地反映出細胞之間的多組學（multiomics）關係（圖一）。

所以近年來，合併單細胞定序，加上空間轉錄組測序（spatial transcriptomics）之應用，可以同時獲得細胞的基因表達及空間位置訊息，此等技術對組織原位細胞真實基因表達的研究邁進了一大步。其在生殖醫學、癌症醫學、神經性疾病、免疫性疾病，都有很廣泛的應用，因本人專業在癌症醫學的領域，所以本文著重在癌症方面，與讀者分享及介紹。

什麼是單細胞定序（single cell sequencing）？

所謂單細胞定序，是從生物體取出的組織，透過一些分離的步驟，分離出單一細胞DNA、RNA遺傳物質，再擴增其基因組、轉錄組或其他多組學進行定序分析，進而得知單一細胞在組織中的異質性，並且提供描繪細胞圖譜的有用資訊。隨著技術的精進，單細胞定序的臨床應用越來越廣，如探討癌症的發生與機制，就與單一細胞的特定基因表現有密切的關係（如圖二）。

單細胞定序可與目前的次世代基因定序（NGS）技術結合，同時分析大量細胞的基因資訊，隨著蛋白質組學（Proteomics）受到重視，負責轉出蛋白質的信使RNA（mRNA），也就是轉錄組（transcriptome）漸成研究的主流。但單細胞定序仍面臨一些發展限制，以癌症為例，由於單細胞的檢體屬於微量組織，很難確保採集組織含有目標腫瘤細胞與遺傳物質。當轉移的腫瘤要採集的樣本是否足夠，亦是一大挑戰。

另外，單細胞定序的過程中，在單細胞懸液採集需要對組織進行酶解，懸液中的單細胞失去了組織空間位置訊息，而且有些單細胞在酶解過程中或離開特定環境後，其基因表達就發生變化，所以近年來，傳統的轉錄組研究轉為空間轉錄組（spatial transcriptome）之階段。以下針對空間轉錄組測序作詳細介紹。

空間轉錄組測序技術的進展

空間轉錄組測序技術，誠如上述，可以對細胞的基因表達進行定量及測量，同時提供細胞在組織空間的具體位置及相關訊息，有此優勢，可以探討在正常與病理狀態下細胞的真正特性。到目前為止，有四種不同空間轉錄組的技術，其特點說明如下：

❶基於原位雜交的空間轉錄組技術：

最早是1960年代，是使用同位素標記的RNA探針進行，直到1980年才將帶有螢光的RNA用作探針，進行螢光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization，FISH）（如圖三），其缺點就是檢測RNA數量有限。另外，檢測的數量及靈敏度較差，只在一個組織，進而無法反映完整單細胞基因表達情況。此技術還包括有組合標記，順序雜交及MER FISH，此牽涉比較深奧技術，不在此贅述。

❷基於高通量測序（High-throughput Sequencing）的空間轉錄組技術：

它有三項技術，第一項為LCM-RNA-Seq技術，此技術早在1996年由Emmert開發，利用激光捕獲顯微切割技術，其組織切片可以用新鮮冷凍組織或福馬林固定之石蠟包埋組織。到了2016年Peng及2018年Moor等人更優化此技術，使激光捕獲顯微切割技術更精進，可以檢測的轉錄本數是高通量，可以直觀，但組織切片會將細胞切破，所捕獲的並不是完整的細胞。第二項叫Slide seq和HDST，是通過磁珠對表面帶有特定條碼序列，可以直觀，分辨率高，但磁珠的捕獲效率仍有待提升。第三種叫Visium的空間轉錄組測序技術，亦屬高通量，操作簡便，高靈敏度，高細胞分辨率，目前較常被使用。（如圖四）

❸基於原位測序的空間轉錄組技術：

以原位測序（ISS）為例，適用於複雜結構的組織或細胞，可以對單個RNA分子進行測序，分辨率高，對研究細胞分化很有用處，但缺點是一次實驗只能識別RNA的數量很少（如圖五）。其他還有較複雜的FISSEQ及STAR map技術，就不再做介紹。

❹基於活細胞標記的空間轉錄組技術：

有TIVA及Zip Seq兩種技術，其特色是非破壞性地從細胞中捕獲mRNA，利用一種光激活的標籤TIVA-tag可以進入細胞，而後在細胞中進行光裂解，將mRNA洗脫下來，進一步進行轉錄組分析。另外，2020年Hu等人亦有另一方法叫Zip Seq，可以檢測傷口癒合過程細胞基因表達之變化狀態。但二者均不適用於大量細胞的分析，空間的分辨率也不高，有待技術的提升。

結合單細胞定序及空間轉錄組測序，對癌症的臨床應用

腫瘤本身及周圍微環境Tumor Microenvironment（TME），主導腫瘤發展與轉移的機制，而微環境中存在複雜的細胞異質性，一直是影響癌症免疫療法的關鍵因素。目前結合單細胞定序及空間轉錄組測序，在乳癌、胰臟癌、肝癌及其他癌症等已有很多研究與探討，本文針對乳癌及胰臟癌新近的研究成果做一些闡述。

英國劍橋大學研究團隊建構了全世界最大的人類乳腺細胞圖譜，揭示凡攜帶有BRCA1和BRCA2基因突變的健康女性早期細胞變化的真面目，這些女性在非癌性的乳腺組織有大量的「精疲力竭」的免疫細胞。在Walid Khaled主持的研究計劃於今年3月28日刊登在《Nature Genetic（自然遺傳學）》2024期刊，他發現此等「精疲力竭」的免疫細胞，無法殺死受損的乳腺細胞，讓這些受損乳腺細胞慢慢變成癌細胞，所以如果偵測此等「精疲力竭」的免疫細胞，在早期還未變成乳癌的階段，也許找到克服這些免疫功能障礙的藥物，及早使用，使乳癌不致發生（如圖六）。

此發現使用的技術正是本文所述的單細胞定序及空間轉錄測序的技術，這個全新的理論與結果頗具潛力，因而獲得英國癌症研究中心頒發「生物學預防獎」的榮銜。

至於胰臟癌方面是所有癌症最難對付的癌症，五年活存率只有10%。在2022年，美國聖路易市華盛頓大學的研究團隊在美國國家衛生院的資助下，利用單細胞定序結合多組學（Multiomics）空間分析技術，揭示胰臟癌發展過程中，正常細胞轉變為癌細胞的演進模式，其成果發表於2022年《Nature Genetic（自然遺傳學）》期刊。

此項研究分析樣本是來自31名胰臟癌患者，連續取出83份胰臟癌檢體進行單細胞RNA定序，另外亦進行全外顯子定序及蛋白組學分析，然後建立了基因表達圖譜，而後根據胰臟癌特定的生物標記Kras訊息傳遞表現、細胞壓力、上皮細胞間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）、癌症轉移機轉，建立癌症進展過程中各種細胞亞群（cell subpopulation）。

根據細胞亞群分類，研究團隊發現兩個關鍵轉變點：①正常胰臟細胞到癌前病變的細胞亞群變化；②癌前細胞到早期癌細胞的轉變。此外研究團隊亦發現此等胰臟癌在腫瘤微環境中有很多種免疫細胞，包括NK、CD4⁺、CD8⁺，還有一種「精疲力竭的免疫細胞」（T cell exhaustion）之高度表達，其預後奇差，未來針對此等細胞找出生物標記，再來針對此等細胞找出對應之標靶，可以在免疫治療扮演重要角色。與上述乳癌一樣在癌症治療中佔有舉足輕重的地位。

以上是針對乳癌與胰臟癌舉例說明，相信此等新型檢測技術對其他癌症一定也有同等重要的地位。諸如對於腫瘤微環境的探討、預測免疫治療的療效及反應、找出新的腫瘤生物標記、監測腫瘤經治療後是否殘存細胞、腫瘤的起始及進展過程的闡述都非常關鍵。

結語

單細胞定序及空間轉錄組測序是一門新興的技術，它能夠在組織切片上原位分析多種基因的表達及相對位置，揭示細胞的空間組織與功能，對於了解細胞的多樣性、組織的異質性、相互作用及彼此的影響，具有重要的價值。

目前已有多家有名公司開發出上述多種技術，但仍有其局限，如靈敏度、專一性、檢測時程及耗用經費，還有通量都有改善空間，如何能更精進仍是一大考驗。另外檢體的收集、處理亦要非常嚴謹，所以一些仍在研究發展階段，要真正廣泛應用要（如圖七）所示。

在癌症醫學方面，臨床實驗室與研究實驗室如何靈活搭配，及相關專業人才如何充分合作，尤其經此技術得到的結果，也要在多專科團隊定期舉辦的分子腫瘤委員會中充分討論，才能實際應用在疑難癌症的診斷與治療上面，使癌症診療的成績更邁進一大步，才能達到更完美的境界。

（圖片來源：Dreamstime/典匠影像）

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